本书首先介绍CRISPR/Cas系统的起源和基本原理，在此基础上详细介绍CRISPR/Cas技术与病原体检测、CRISPR/Cas技术与耐药检测、CRISPR/Cas技术与肿瘤检测、CRISPR/Cas技术与非传染病原体检测、CRISPR/Cas技术与小分子检测，CRISPR/Cas技术与新冠病毒突变株检测以及CRISPR/Cas现存的技术瓶颈及可能的解决方案等。作为一本涵盖CRISPR理论和应用技术的工具书，将全面反映CRISPR/Cas技术的国内外最新进展；并详细介绍相关技术操作细节和方法，力求使零基础读者能借此独立开展实验设计和操作，并取得预期实验结果，促进新技术推广和产业化。

作为一本涵盖CRISPR理论和应用技术的工具书，将全面反映CRISPR/Cas技术的国内外最新进展；并详细介绍相关技术操作细节和方法，力求使零基础读者能借此独立开展实验设计和操作，并取得预期实验结果，促进新技术推广和产业化。

CRISPR/Cas 技术的创新发展推动生命科学研究进入了划时代的新阶段。CRISPR/Cas 基因编辑技术用于肿瘤和遗传病等难以治愈疾病的治疗，创建了基因治疗新方法。法国科学家卡彭蒂耶和美国科学家杜徳娜在CRISPR/Cas 研究与应用领域做出了杰出贡献，被授予2020 年诺贝尔化学奖。
CRISPR/Cas 技术在分子诊断领域展现了巨大潜力，是继聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术之后，备受关注的又一个里程碑，已广泛应用于感染性和非感染性疾病的筛查与诊断。2018 年，Science 杂志将CRISPR/Cas 分子诊断技术称为新一代分子诊断方法。2022 年，Nature 杂志将CRISPR/Cas 分子诊断技术列为当年最值得关注的七项技术之一。
为了适应国际前沿技术发展，积极普及生物诊断新知识、推广新技术，促进产业化快速发展，中国医药生物技术协会生物诊断技术分会在时任主任委员李银太教授的主持下，组织相关专家历经两年多时间编写了《CRISPR 分子诊断技术原理及应用》一书。全书分上、中、下三篇，系统介绍了CRISPR 分子诊断技术原理、技术方法及在生物诊断领域应用的最新进展。此外还介绍了一种具备核酸内切酶活性的Argonaute 核酸酶及其在分子诊断中的应用。
本书既注重描述CRISPR 相关技术基本原理，又比较详细介绍了实验方法及设计理念，并提供了系列分子诊断实例，期望能为读者提供具有参考价值的理论知识和操作指南。由于该前沿技术发展日新月异，新方法和新应用不断涌现，难免挂一漏万，敬请读者谅解。
在此，谨代表中国医药生物技术协会生物诊断技术分会，对所有为本书编辑问世做出贡献的专家和同道表示衷心感谢！
中国医药生物技术协会生物诊断技术分会主任委员
李越希
2024 年10 月于南京

专业技术少将主任医师，享受国务院特殊津贴。江苏省医药生物技术重点实验室主任、南京市生物（基因）医药工程技术中心主任，负责的医药生物技术研究所为国家博士后科研工作站。国家863疫苗项目总体组专家，江苏省医学领军人才，江苏省重点学科带头人，全军医药生物技术学科带头人。中国药科大学、南京医科大学、徐州医科大学博士生导师。

绪论/1
一、CRISPR/Cas系统的发现/1
二、CRISPR/Cas系统的组成与分类/2
三、CRISPR/Cas系统在分子诊断中的应用/3
四、CRISPR分子诊断技术的研究热点及发展方向/4
上篇CRISPR分子诊断技术
第一章CRISPR/Cas蛋白作用原理与应用/8
第一节CRISPR/Cas蛋白分类与功能/8
一、1类CRISPR/Cas蛋白/9
二、2类CRISPR/Cas蛋白/10
第二节CRISPR分子诊断技术应用/15
一、CRISPR分子诊断技术工作原理/15
二、CRISPR分子诊断体系/18
第二章CRISPR技术与核酸现场快速检测/27
第一节智能手机CRISPR技术/27
一、技术原理/27
二、技术方法/29
第二节基于环介导恒温扩增/侧向流层析的CRISPR技术/31
一、技术原理/31
二、技术方法/31
第三节基于重组酶聚合酶恒温扩增/侧向流层析的CRISPR技术/32
一、技术原理/32
二、技术方法/33
第四节可穿戴的CRISPR诊断装备/34
一、技术原理/34
二、技术方法/35
第五节CRISPR分子诊断一体机快检系统/36
一、SmartRanger一体机/36
二、BG-Nova-X8一体机/37
第三章CRISPR多重检测技术/40
第一节单管多重CRISPR分子检测/40
一、单管四重CRISPR分子检测/40
二、单管双重CRISPR分子检测/41
三、恒温扩增联合CRISPR分子双重检测/42
第二节多反应容器多重CRISPR分子检测/43
一、基于并联反应管的多重CRISPR分子检测/43
二、微流控多重CRISPR分子检测平台/44
三、纸基微流控多重CRISPR分子检测/44
四、全自动多重CRISPR分子检测/45
五、CARMEN微流控CRISPR分子检测平台/45
第四章免核酸扩增CRISPR分子诊断/48
第一节免核酸扩增检测技术/48
一、Cas9免核酸扩增检测/48
二、Cas12免核酸扩增检测/51
三、Cas13免核酸扩增检测/54
四、多重CRISPR/Cas系统级联法检测/59
第二节免核酸扩增CRISPR分子诊断技术的应用/61
一、液滴微流控定量检测方法/61
二、多条crRNA联合检测/63
三、基于纳米金探针的免核酸扩增检测/65
第五章CRISPR分子诊断系统信号输出/69
第一节检测信号输出方式/69
一、光学信号/69
二、电化学信号/73
三、侧向流层析试纸条显色/74
四、其他信号输出方式/74
第二节CRISPR分子信标系统/75
第六章CRISPR非核酸靶标检测技术/84
第一节离子检测/85
第二节小分子化合物检测/87
一、ATP检测/87
二、抗生素检测/90
三、代谢物检测/90
四、三聚氰胺检测/91
五、毒物检测/91
第三节多糖检测/91
第四节蛋白质检测/92
一、多肽检测/92
二、蛋白标志物检测/94
三、干扰素检测/96
四、蛋白酶检测/96
五、酶活性检测/97
第五节细胞检测/98
第六节转录因子检测/100
中篇CRISPR分子诊断技术应用
第七章病原微生物检测/106
第一节李斯特菌检测/107
一、技术原理/107
二、技术方法/108
第二节结核分枝杆菌检测/109
一、技术原理/109
二、技术方法/110
第三节炭疽杆菌检测/111
一、技术原理/111
二、技术方法/112
第四节烟曲霉检测/114
一、技术原理/114
二、技术方法/114
第八章病毒变异检测与分型/116
第一节SARS-CoV-2变异株检测/116
一、SARS-CoV-2变异株/116
二、基于CRISPR/Cas技术的SARS-CoV-2变异株检测/119
三、重组酶辅助扩增#NAME?快速检测SARS-CoV-2Omicron
变异体/127
第二节寨卡病毒检测及分型/134
一、寨卡病毒制备与处理/135
二、NASBA反应/135
三、NASBACC反应/135
第九章特殊病原体检测/139
第一节支原体检测/139
一、肺炎支原体检测/139
二、人型支原体检测/140
第二节螺旋体检测/142
第三节诺卡菌检测/143
一、鼻疽诺卡菌检测/143
二、盖尔森基兴诺卡菌检测/144
第十章肿瘤诊断/147
第一节DNA点突变检测/147
一、依赖PAM的单核苷酸差异检测/147
二、不依赖PAM的罕见点突变检测/148
第二节DNA甲基化检测/150
一、技术原理/151
二、技术方法/151
第三节肿瘤微小RNA检测/152
一、基于Cas9的微小RNA检测/152
二、基于Cas12a的微小RNA检测/153
第四节肿瘤蛋白标志物检测/154
一、技术原理/155
二、技术方法/155
第十一章非感染性疾病诊断/158
第一节CRISPR检测趋化因子配体mRNA/158
一、技术原理/158
二、技术方法/159
第二节CRISPR-FISH检测线粒体DNA突变/159
一、技术原理/159
二、技术方法/160
第三节CRISPR-层析技术检测DNA缺失突变/164
一、技术原理/164
二、技术方法/164
第四节CRISPR-酶联免疫吸附试验/165
一、技术原理/165
二、技术方法/166
第五节CPISPR-链置换扩增检测/167
一、技术原理/167
二、技术方法/169
第六节CRISPR-适配体传感器/171
一、技术原理/171
二、技术方法/171
第十二章耐药基因检测/176
第一节-内酰胺类耐药基因检测/176
一、技术原理/176
二、技术方法/177
三、技术特点/178
第二节氨基糖苷类耐药基因检测/179
一、技术原理/179
二、技术方法/180
三、技术特点/180
第三节乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因检测/181
一、技术原理/181
二、技术方法/182
三、技术特点/183
第四节流行性感冒病毒奥司他韦耐药基因检测/183
一、技术原理/183
二、技术方法/184
三、技术特点/185
第五节疟原虫磺胺多辛耐药基因检测/185
一、技术原理/185
二、技术方法/186
三、技术特点/187
第六节肺癌靶向药物表皮生长因子受体耐药基因检测/188
一、技术原理/188
二、技术方法/189
三、技术特点/190
第七节急性髓系白血病靶向药物FLT3耐药基因检测/190
一、技术原理/190
二、技术方法/191
三、技术特点/192
第十三章食品安全检测/195
第一节核酸靶标检测/195
一、CRISPR-光热可视化双模式检测/206
二、CRISPR-G四联体耦合技术的智能手机检测/208
三、CRISPR-表面增强拉曼散射微流控检测/211
四、CRISPR-表面增强拉曼散射可视化检测/213
五、CRISPR快速鉴别清真食品/215
第二节非核酸靶标检测/217
一、CRISPR-适配体传感器检测ATP/221
二、CRISPR-上转发光生物传感器/222
三、CRISPR-纳米链级联荧光适配传感器/224
下篇Argonaute分子诊断系统
第十四章Argonaute核酸酶/232
第一节Ago分类系统/232
一、Ago分子进化/232
二、Ago结构特征/233
第二节Ago催化活性与生物学功能/236
一、核酸酶活性/236
二、生物学功能/236
第三节Ago催化机制/238
一、依赖引导链剪切/238
二、不依赖引导链剪切/239
三、碱基错配对剪切的影响/239
四、引导链的5端修饰对剪切的影响/240
第四节Ago基因编辑与核酸检测/240
一、Ago基因编辑/240
二、Ago核酸检测/241
三、Ago成像技术/249
第十五章Ago检测肿瘤及遗传病低丰度基因/254
第一节技术原理/255
第二节技术方法/255
第三节技术特点/260
第十六章Ago检测病原体核酸/262
第一节技术原理/262
第二节技术方法/264
第三节技术特点/270