持留菌是细菌在生长过程中随机形成的规模小、呈休眠状态且高度耐受抗生素的菌体亚群。已有实验证明，细菌持留性与临床上细菌慢性感染及耐药性的产生相关。由于细菌持留性的分子机制复杂多变，给人类健康带来诸多挑战。作者从细菌持留性的基本概念、分子机制研究及相关实验操作等方面进行了系统介绍，重点讨论了开展细菌持留性科学研究的相关方法，以及不同分子机制实验研究的具体操作规程。本教材阐释系统、图表简洁，兼具理论指导性和实际操作性，可作为国内高等院校开展相关微生物学实验教学的指导用书，也可供从事细菌持留性相关研究的科研人员借鉴参考。

本书将系统介绍持留菌形成的不同分子机制及相关实验研究的经典操作规程，为从事细菌持留性相关研究的科研人员提供理论依据和技术指导，帮助科研教学人员深入探索持留菌的遗传学与生物学特性，同时指导高校师生开展与持留菌相关的实验教学活动。填

周建华，博士，副研究员，硕士研究生导师。任职于西北民族大学生物医学研究中心，主要研究方向为病原生物学与基因工程。先后主持国家自然科学基金 2 项、甘肃省自然科学基金 1 项、优秀青年团队培育项目 1 项、西北民族大学引进人才科研项目 1 项及企业横向研究课题 1 项。以第一发明人身份获发明专利 1 项，主译专著《细菌持留状态研究方法与操作规程》，以第一作者或通讯作者身份于 SCI 期刊发表学术论文 7 篇，于 CSCD-C 中文期刊发表学术论文 4 篇。 马晓霞，博士，副教授，硕士研究生导师。先后担任西北民族大学生命科学与工程学院、生物医学研究中心教师，曾赴荷兰鹿特丹伊拉兹马斯大学医学中心肝病与肠道病研究组短期访学。主要研究方向为病毒基因工程与病原遗传学。先后主持甘肃省教育厅科技项目 1 项、中央高校基本业务科研项目 2 项，参与国家自然科学基金 4 项、国家教育部创新团队项目及科技重大专项各 1 项。主编教材 2 部，以第一作者或通讯作者身份于 SCI 期刊发表学术论文 21 篇（累计影响因子 40 分），于CSCD-C 中文期刊发表学术论文 3 篇。

目? 录 第 1 章? 细菌持留性的基础知识 001 一、细菌持留性的概念 001 二、细菌持留性的研究现状及展望 002 第 2 章? 持留菌形成的分子机制概论 004 一、毒素 - 抗毒素系统 004 二、遗传因素对持留菌形成的影响 006 三、生物被膜形成的分子机制 007 四、细菌“社区”网络的形成 010 第 3 章? 持留菌生物表型的鉴定 013 一、Ⅰ型 / Ⅱ型持留菌生物表型的鉴定 013 二、持留菌分离及鉴定的实验操作 014 三、ScanLag 实验法对Ⅰ型 / Ⅱ型持留菌的定量测定 017 第 4 章? 重要持留菌形成的分子机制与临床疾病 020 一、大肠杆菌持留性的分子机制 020 二、沙门菌持留性的分子机制 023 三、鲍曼不动杆菌持留性的分子机制 030 四、结核分枝杆菌持留性的分子机制 034 五、铜绿假单胞菌持留性的分子机制 036 六、肺炎克雷伯菌持留性的分子机制 037 七、金黄色葡萄球菌持留性的分子机制 040 八、白念珠菌持留性的分子机制 043 第 5 章? 持留菌研究经典实验技术 045 一、基因定点突变技术的实验操作 045 二、持留菌基因敲除技术的实验操作 049 三、针对持留菌的免疫荧光与激光共聚焦技术 054 四、核酸探针筛选基因文库的实验操作 057 五、荧光活化细胞分选的实验操作 061 六、微型液滴矩阵对持留菌的检测与收集 066 七、生物被膜形成定量检测的实验方法 070 第 6 章? 大肠杆菌持留性研究的常用实验技术 074 一、常规实验方法分析大肠杆菌持留状态的操作规程 074 二、优化实验方法进行大肠杆菌持留性分析的操作规程 076 三、毒素 - 抗毒素系统关键位点鉴定的实验操作 080 四、周期性抗生素处理诱导持留性大肠杆菌形成的实验操作 084 五、小鼠泌尿道持留性大肠杆菌感染模型的建立 087 第 7 章? 其他重要持留菌相关研究的经典实验操作 095 一、持留性铜绿假单胞菌高通量筛选的实验操作 095 二、金黄色葡萄球菌生物被膜体外模型的建立 099 三、金黄色葡萄球菌转座子文库构建的实验操作 101 四、鲍曼不动杆菌持留性鉴定的实验操作 106 五、白念珠菌生物被膜中持留菌检测的实验方法 109 第 8 章? 细菌 - 真菌混合产生生物被膜诱导持留菌产生的实验操作 113 一、表皮葡萄球菌 - 白念珠菌混合产生生物被膜的实验操作 113 二、铜绿假单胞菌 - 烟曲霉混合产生生物被膜的实验操作 117 参考文献 120

第 1 章? 细菌持留性的基础知识 一、细菌持留性的概念 抗生素在控制临床感染性疾病方面可谓是现代医学的基石。20 世纪中期甚至被称为“抗生素时代”，人们认为到 20 世纪末，传染病将被根除，人类预期寿命将大幅提高。同样，针对器官移植、风湿病学科及肿瘤学等具有高侵入性和高端手术要求的免疫调节治疗也发挥着关键作用。然而，越来越多的细菌正在对目前使用的多种抗生素产生抗药性，导致出现了多重耐药（multidrug-resistant，MDR）细菌。因发现青霉素而获得诺贝尔生理学或医学奖的 Alexander Fleming 教授警告过抗生素的过度滥用可能导致细菌的广泛耐药性。由于新的抗微生物药物很少，并且由于MDR 细菌的普遍存在导致治疗失败，抗生素耐药细菌已成为现代医疗保健的重大威胁。 多国政府与世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和联合国（United Nations，UN）一起致力于减少和预防细菌耐药趋势的不断发展，这是一场与时间赛跑的竞赛。瑞士达沃斯世界经济论坛 2019 年的最新报告强调了采取有效措施来应对“传染病的快速和大范围传播”的必要性，这是人类健康面临的最大威胁之一。抗生素耐药细菌引起的感染每年在全球范围内造成数十万人死亡，并估计在 2050 年每年将导致超过 1000 万人死亡。另外，植入式医疗器械在高端手术治疗中使用频率的增加，如关节假体、人工心脏瓣膜、血管内假体和起搏器，导致生物被膜相关感染的发生率增加，这反过来又导致另一个重要现象：抗生素耐受性。抗生素耐受性使细菌能够在标准微生物学检测中完全敏感的情况下，在抗生素高强度选择压力下存活下来。通过使用体外实验和数学建模，Balaban 及其同事最近表明，耐受性可以先于耐药性出现，而耐受性突变可以导致抗生素耐药性的快速进化。 抗生素耐药通常导致延迟充分的抗生素治疗，增加发病率和死亡率。抗微生物耐药性（anti-microbial resistence，AMR）是微生物在高抗生素浓度下生长的遗传能力。通常通过测量特定抗生素的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）来量化，其中耐药细菌能够在抗生素的致命浓度下繁殖和生长，而这对同一物种的其他菌株是致命的。抗生素耐药有不同的类型。一方面，由于缺乏或存在某些结构而导致抗生素无效的天然内在耐药性。另一方面，细菌可以通过染色体基因的突变或染色体或质粒的水平基因转移获得耐药性。在诸多耐药表型的菌株中，持留菌对人类健康威胁不容小觑。 持留菌指在致死性抗生素浓度的环境中，可耐受抗生素、菌群占比小、休眠 / 增殖缓慢、无表型遗传性的病原微生物。病原菌的持留表型最早发现于 20 世纪 40 年代，但是由于当时实验平台未能有效满足持留菌培养过程中的各种条件要求，相关形成机制的研究进展缓慢。随着分子生物学、细胞生物学及免疫学技术的飞速发展，科研人员建立了一系列高效且稳定性强的实验方法，这促使了持留菌生理学、分子形成机制及遗传学研究的突破。在诸多新创实验方法的产生前，持留菌表型分析、抗性分析、生长抑制诱导、单菌培养分离等实验方法给后续实验技术的升级奠定了坚实基础。我们将重点介绍常见持留菌形成的分子机制，以及相关实验操作步骤。