《细胞工厂设计与应用技术》聚焦合成生物学核心领域，系统阐述细胞工厂设计与构建的关键技术体系及其应用。从资源型、驯化型等多类型细胞工厂的筛选与设计技术开始，深入解析热力学与动力学驱动机制，详解逻辑基因线路的设计原理、开发规程及应用场景。同时，围绕合成途径与物质流的多层面设计调控、代谢过程的数字化模拟与智能设计方法展开，全面介绍底盘细胞的设计开发技术、细胞工厂快速构建流程，以及定向进化与适配优化方案。
全书以“设计原理—技术规程—问题及解决方案—应用案例”为脉络，构建从基础设计到工程化应用的完整知识框架，可供生物化工、生物工程、合成生物学、化学工程、食品科学等相关领域学生、研究人员和产业工程师查阅参考。
李春，清华大学化学工程系教授，工业生物催化教育部重点实验室主任，绿色生物制造全国重点实验室学术带头人。长期从事代谢工程与合成生物学、生物催化与酶工程的研究，聚焦甘草萜烯类和黄酮类天然产物的酶转化与微生物合成，工业菌种智能抗逆分子设计与工程应用。2014年获国家杰出青年科学基金，2019年担任国家重点研发计划 “合成生物学”专题首席科学家。已完成植物油脂酶法脱胶、甘草次酸的生物制造、多重耐热酵母发酵生产乙醇等技术的中试试验，研制的植物解盐促生菌剂实现了产业化应用。在Angew Chem、ACS Catal、ACS Energ Lett、Nature Comm等期刊发表论文450余篇，获授权发明专利41项，获省部级科技成果奖4项。编著教材和专著十多部章。
第1章 细胞工厂设计技术的发展 001
1.1 目标测试可设计的资源型细胞工厂筛选技术 002
1.1.1 产生的背景和需求 002
1.1.2 技术原理与流程 002
1.1.3 应用 002
1.2 目标随机可诱变的驯化型细胞工厂选育技术 003
1.2.1 产生的背景和需求 003
1.2.2 技术原理与流程 003
1.2.3 应用 003
1.3 目的基因表达可变的调控型细胞工厂设计技术 004
1.3.1 产生的背景和需求 004
1.3.2 技术原理与流程 004
1.3.3 应用 005
1.4 基于多组学目标导向的系统型细胞工厂设计技术 005
1.4.1 产生的背景和需求 005
1.4.2 基本原理与流程 006
1.4.3 应用 006
1.5 合成生物学理论指导的工程型细胞工厂设计技术 007
1.5.1 产生的背景和需求 007
1.5.2 基本原理与流程 007
1.5.3 应用 008
参考文献 009
第2章 细胞工厂热力学与动力学驱动设计技术 011
2.1 细胞工厂热力学与动力学驱动概念与发展 012
2.2 细胞工厂中热力学与动力学驱动设计原理 013
2.2.1 细胞工厂动力学驱动设计原理 013
2.2.2 细胞工厂热力学驱动设计原理 015
2.3 关键酶的热力学与动力学驱动设计技术规程 016
2.3.1 关键酶的挖掘与表征技术规程 016
2.3.2 关键酶的（半）理性设计与改造技术规程 025
2.3.3 关键酶的定向进化与筛选技术规程 027
2.4 细胞工厂底物摄取优化技术规程 028
2.4.1 底盘细胞的选择 029
2.4.2 基因整合与表达 030
2.4.3 发酵条件的优化 031
2.4.4 酶的选择与改造 032
2.5 细胞工厂代谢途径表达平衡技术规程 033
2.5.1 启动子工程 034
2.5.2 RNA调控因素 035
2.5.3 代谢物响应 035
2.5.4 群体感应响应 036
2.5.5 环境响应 036
2.5.6 蛋白质水平调控 036
2.6 细胞工厂产物外排/储存强化技术规程 037
2.6.1 产物外排机制与策略 038
2.6.2 产物储存机制与策略 041
2.7 细胞工厂中辅因子驱动设计技术规程 043
2.7.1 重构辅因子的生物合成途径 043
2.7.2 提升胞内辅因子代谢水平 045
2.7.3 平衡辅因子稳态 046
2.7.4 辅因子偏好性 047
参考文献 049
第3章 逻辑基因线路设计技术 051
3.1 逻辑基因线路的概念与发展 052
3.2 逻辑基因线路的设计原理 052
3.2.1 转录水平调控元件的设计原理 053
3.2.2 翻译水平调控元件的设计原理 056
3.2.3 细胞水平感应元件的设计原理 057
3.3 逻辑基因线路的设计与开发技术规程 058
3.3.1 原核工程细胞中逻辑门的设计与开发技术规程 058
3.3.2 真核工程细胞中逻辑门的设计与开发技术规程 068
3.3.3 细胞群体中逻辑门的设计技术规程 080
3.4 逻辑基因线路设计技术常见问题与解决 086
3.4.1 逻辑基因线路的鲁棒性 086
3.4.2 逻辑基因线路的稳定性 088
3.4.3 逻辑基因线路的可扩展性 089
3.4.4 逻辑基因线路的可预测性 091
3.4.5 逻辑基因线路的响应效率 092
3.5 逻辑基因线路设计技术的应用 093
3.5.1 基于合成基因线路构建边缘检测算法 093
3.5.2 设计自控基因线路实现环境汞的生物修复 093
3.5.3 合成基因线路用于基因治疗 095
参考文献 099
第4章 细胞工厂合成途径及物质流设计技术 101
4.1 细胞工厂中合成途径及物质流设计技术概念与发展 102
4.2 细胞工厂中合成途径的解析和人工设计原理 102
4.2.1 化合物合成途径的解析 102
4.2.2 化合物合成途径的人工设计原理 103
4.3 细胞工厂中物质流的设计原理 104
4.3.1 分子水平物质流的设计原理 104
4.3.2 细胞水平物质流的设计原理 105
4.3.3 群体水平物质流的设计原理 105
4.4 细胞工厂合成途径设计技术规程 106
4.4.1 化合物合成途径的人工设计技术规程 106
4.4.2 化合物合成途径的人工改造技术规程 109
4.5 细胞工厂中物质流的设计技术规程 110
4.5.1 DNA水平的设计与调控技术规程 110
4.5.2 RNA水平的设计与调控规程 114
4.5.3 蛋白质水平的设计与调控技术规程 115
4.5.4 小分子水平的设计与调控规程 119
4.5.5 细胞生长物质流的设计技术规程 121
4.5.6 化合物合成与细胞生长物质流平衡设计技术规程 123
4.5.7 混合菌群物质流的交互设计与调控 125
4.6 细胞工厂中合成途径及物质流设计技术应用常见问题与解决 127
4.6.1 异源途径与底盘细胞的适配性 127
4.6.2 密码子优化 128
4.6.3 表达调控 129
4.6.4 动态调控 129
4.7 细胞工厂中合成途径及物质流设计技术的应用与分析 131
4.7.1 细胞工厂中合成途径的应用与分析 131
4.7.2 细胞工厂中物质流设计技术的应用与分析 134
参考文献 137
第5章 细胞工厂代谢的数字化模拟与智能设计方法 139
5.1 细胞工厂代谢的数字化模拟与智能设计的概念与发展 140
5.2 细胞工厂的代谢模型及配套智能设计方法介绍 144
5.2.1 化学计量代谢模型及配套的代谢通量分析方法 144
5.2.2 第一代高级代谢模型及配套的代谢通量分析方法 147
5.2.3 第二代高级代谢模型及配套的代谢通量分析方法 148
5.2.4 第三代高级代谢模型及配套的代谢通量分析方法 152
5.3 基于代谢模型的工程菌智能设计技术规程 157
5.3.1 通量平衡分析工具—COBRA工具箱技术规程 157
5.3.2 通量平衡分析算法（FVA）的使用 162
5.3.3 第一代高级代谢模型构建工具—COBRA工具箱 163
5.3.4 第二代高级代谢模型构建工具—GECKO3.0的使用技术规程 163
5.4 细胞工厂代谢的数字化模拟与智能设计方法常见问题及解决方案 167
5.4.1 COBRA工具箱常见问题与解决方案 167
5.4.2 GECKO工具箱常见问题与解决方案 168
5.5 细胞工厂的数字化模拟与智能设计方法的应用 168
5.5.1 利用化学计量代谢模型对宿主菌株工程改造 169
5.5.2 利用高级代谢模型对宿主菌株工程改造 172
参考文献 177
第6章 细胞工厂底盘设计与开发技术 179
6.1 细胞工厂底盘设计与开发技术的概念与发展 180
6.2 细胞工厂底盘的设计原理 182
6.2.1 “自上而下”的底盘细胞设计原理 182
6.2.2 “自下而上”的底盘细胞设计原理 183
6.2.3 底盘细胞的人工设计原理 184
6.2.4 数字细胞的人工设计原理 186
6.3 细胞工厂底盘的设计与开发技术规程 187
6.3.1 底盘细胞转运系统设计与开发技术规程 187
6.3.2 常见模式底盘细胞设计与开发技术规程 192
6.3.3 常见非模式底盘细胞设计与开发技术规程 225
6.4 细胞工厂底盘设计与开发技术常见问题与解决 232
6.4.1 底盘细胞的选择 232
6.4.2 底盘细胞的代谢优化 232
6.4.3 底盘细胞的转运系统开发 233
6.4.4 基因组大片段的删除或插入 233
6.4.5 非模式菌的改造 233
6.5 细胞工厂底盘设计与开发技术的应用 234
6.5.1 应用例子1：大肠杆菌 235
6.5.2 应用例子2：酿酒酵母 236
6.5.3 应用例子3：乳酸菌 238
参考文献 239
第7章 细胞工厂快速构建技术 241
7.1 自动化技术的概念与发展 242
7.2 细胞工厂快速构建原理 249
7.2.1 自动化合成生物技术—构建 250
7.2.2 自动化合成生物技术—测试 252
7.3 细胞工厂快速构建技术规程 253
7.3.1 细胞工厂中工程DNA快速构建及应用技术规程 253
7.3.2 细胞工厂中基因组快速编辑技术规程 271
7.3.3 自动化平台的设计与搭建技术规程 283
7.4 细胞工厂快速构建技术常见问题与解决 288
7.4.1 错误应用 289
7.4.2 工艺/软硬件迭代 289
7.4.3 限制创新 289
7.4.4 对研究人员的影响 290
7.4.5 人工实验/自动化工艺流程技术壁垒 290
7.4.6 在自动化设施平台搭建及应用过程中需要研究者思考的一些科学问题 291
7.5 细胞工厂快速构建技术的应用 291
7.5.1 方法和材料 292
7.5.2 实验结果 294
7.6 总结 300
7.6.1 自动化设施平台助力模式微生物生物制造 301
7.6.2 自动化设施平台助力非模式微生物细胞工厂研发 301
参考文献 302
第8章 细胞工厂定向进化与适配技术 303
8.1 细胞工厂定向进化与适配技术的概念与发展 304
8.2 外源途径定向进化与底盘适配技术原理 305
8.2.1 基因拷贝数水平的途径定向进化与底盘适配技术原理 305
8.2.2 转录水平的途径定向进化与底盘适配技术原理 306
8.2.3 蛋白质水平的途径定向进化与底盘适配技术原理 308
8.3 细胞工厂基因组定向进化与适配技术原理 311
8.3.1 非理性基因组定向进化与适配技术原理 311
8.3.2 半理性基因组定向进化与适配技术原理 313
8.4 外源途径定向进化与适配技术规程 316
8.4.1 基因拷贝数水平的途径定向进化与底盘适配技术规程 316
8.4.2 转录水平的途径定向进化与适配技术规程 317
8.4.3 蛋白质水平的途径定向进化与底盘适配技术规程 323
8.5 细胞工厂基因组定向进化与适配技术规程 328
8.5.1 非理性基因组定向进化与适配技术规程（大肠杆菌） 328
8.5.2 非理性基因组定向进化与适配技术规程（酿酒酵母） 330
8.5.3 半理性基因组定向进化与适配技术规程（大肠杆菌） 332
8.5.4 半理性基因组定向进化与适配技术规程（酿酒酵母） 334
8.6 细胞工厂定向进化与适配技术常见问题与解决 336
8.6.1 文库多样性 336
8.6.2 高通量筛选 337
8.7 细胞工厂定向进化与适配技术的应用 338
8.7.1 通过组合转录工程定制优化代谢途径 338
8.7.2 利用全局转录机器工程（gTME）提高乙醇耐受性 340
8.7.3 基于启动子库的途径优化提高酿酒酵母中(2S)-柚皮素的合成水平 341
8.7.4 大肠杆菌中脂肪酸合成途径的定向进化和适配优化 342
8.7.5 基因组定向进化拓展酵母的底物利用范围 344
8.7.6 基于R-M系统的基因组定向进化加速大肠杆菌生长 344
8.7.7 多功能全基因组规模进化技术提高酿酒酵母细胞耐受性 345
8.7.8 利用MAGE构建和筛选番茄红素高产菌株 345
8.7.9 基因组规模靶标鉴定用于在大肠杆菌中高效生产游离脂肪酸 347
参考文献 350
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